Międzyinstytutowe Laboratorium Biotechnologii i Katalizy Enzymatycznej

Badania Międzyinstytutowego Laboratorium Biotechnologii i Katalizy Enzymatycznej, pracującego w oparciu o bazę sprzętową Instytutu Katalizy oraz Instytutu Fizjologii Roślin Polskiej Akademii Nauk skupiają się na badaniu enzymów katalizujących reakcje syntezy chiralnie czystych alkoholi alkiloaromatycznych. Obecnie laboratorium zajmuje się głównie trzema systemami enzymatycznymi, dehydrogenazą etylobenzenową (EBDH), dehydrogenazą fenyloetanolową (PEDH) oraz dehydrogenazą C25 steroidową. Badania prowadzone w MLBKE są częścią dużego projektu POIG "Biotransformacje dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego" oraz projektu NCBiR "Regioselektywne utlenianie pochodnych cholesterolu za pomocą nowego enzymu molibdenowego – dehydrogenazy 25-OH cholesterolowej".

Laboratorium stanowi dodatkowo platformę integracji środowisk naukowych, dając możliwość połączenia bazy sprzętowo-badawczej Instytutu Katalizy i Fizykochemii Powierzchni z Instytutem Fizjologii Roślin.

EBDH

Dehydrogenaza etylobenzenowa (EBDH) jest bakteryjnym enzymem z należącym do mononuklearnych enzymów molibdenowych z rodziny reduktaz DMSO. EBDH jest pierwszym, kluczowym enzymem w beztlenowym szlaku mineralizacji etylobenzenu, który umożliwia wzrost bakterii na pożywce bogatej w etylobenzen i azotany w środowisku beztlenowym.

Enzymy molibdenowe charakteryzują się specyficznym centrum aktywnym, zawierającym pojedynczy atom molibdenu, jeden lub dwa kofaktory pterydynowe oraz dodatkowe ligandy - najczęściej resztę aminokwasową (Ser, Cys, SeCys, Asp) oraz zazwyczaj ligand tlenowy Mo=O.

pterindin cofactor coordinating molybdenum atom

EBDH structure

kofaktor molibdenowy

struktura EBDH

 

Podstawowym obiektem badań jest dehydrogenaza etylobenzenowa (EBDH), złożony enzym bakteryjny ( αβγ 164 kDa) zawierający centrum monomolibdenowe (MoCo), klastery żelazo-siarkowe oraz grupę hemową typu b559, katalizujący stereospecyficzną reakcję hydroksylacji etylobenzenu do 1-(S)-fenyloetanolu.


PEDH

Dehydrogenaza fenyloetanolowa stanowi drugi enzym szlaku biomineralizacji etylobenzenu w bakterii PEDH należy do rodziny krótkołańcuchowych dehyrogenaz alkoholowych/reduktaz aldehydowych. PEDH jest homotetramerycznym enzymem o masie cząsteczkowej 108 kDa. Katalizuje zależne od NAD+  utlenienie (S)-1-fenyloetanolu do acetofenonu lub zależną od NADH stereospecyficzną redukcję acetofenonu do (S)-1-fenyloetanolu.

Badania nad PEDH koncentrują się na aspekcie aplikacyjnym ze względu na potencjalną możliwość zastosowania go w biosyntezie chiralnie czystych alkoholi alkiloaromatycznych. Zastosowanie enzymu do takich syntez jest chronione prawnie przez wspólny patent odkrywcy enzymu, prof. Johanna Heidera z Uniwersytetu w Marburgu oraz firmę BASF AG. Prowadzone w Laboratorium badania mają za zadanie opracować optymalne warunki zastosowania enzymu w przemysłowej syntezie.

S25DH

Dehydrogenaza C25 steroidowa (S25DH) została wyizolowana z bakterii . Enzym, podobnie jak EBDH, jest heterotrimerem (αβγ 169 kDa) zawierającym centrum molibdenowe (MoCo), centra żelazowo-siarkowe oraz kofaktor hemowy. S25OH katalizuje regioselektywną reakcję hydroksylacji pochodnych cholesterolu do C-25 hydroksylowanych produktów: np. cholest-4-en-3-onu do 25-hydroksycholest-4-en-3-onu.

Badania aplikacyjne nad enzymem prowadzone są przy współpracy z Instytutem Fizjologii Roślin PAN oraz z Katedrą Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu w ramach projektu LIDER III pt.: „Regioselektywne utlenianie pochodnych cholesterolu za pomocą nowego enzymu molibdenowego - dehydrogenazy 25-OH cholesterolowej” (LIDER/33/147/L-3/11/NCBR/2012). Ponadto badania nad mechanizmem reakcji S25DH prowadzone są w ramach projektu SONATA "Mechanizm regioselektywnego utleniania pochodnych cholesterolu przez nowy enzym molibdenowy, dehydrogenazę 25-OH sterolową ze Sterolibacterium denintrificans" przy współpracy z IFR PAN,  Katedrą Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oraz Instytutem Farmakologii PAN.

 

W ramach realizowanego projektu stworzono unikatowe zaplecze laboratoryjne pozwalające na:

  • prowadzenie hodowli bakteryjnej w warunkach beztlenowych
  • izolację i badania nad S25DH w warunkach beztlenowych.

W skład utworzonego zaplecza laboratoryjnego wchodzą:

  • zautomatyzowany system anaerobizacji buforów, pracujący w systemie gaz/próżnia;
  • anaerobowa komora rękawicowa Coy® z atmosferą 97/3 % N2/H2 i pomiarem stężenia tlenu do 1 ppm, wyposażona w:
    • FPLC (Pharmacia®),
    • złoża do oczyszczania białek,
    • lodówkę chłodzącą bufory i pozyskiwane białko do 60C
    • wirówkę na falkony 50 ml.

Celem pozyskania zadowalających ilości masy bakteryjnej przeznaczonej do izolacji S25DH uruchomiono ciągłą hodowlę S. denitrificans w warunkach beztlenowych, w płynnej pożywce mineralnej z cholesterolem w skali 0,5 l. Dodatkowo, nawiązano współprace z Katedrą Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, gdzie wykonywana jest wielkoskalowa hodowla bakterii natywnej (100 l). Równolegle prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem systemu nadekspresji pozwalającego na produkcję rekombinowanego S25DH.

Badania nad S25DH w sposób popularny przedstawiono na filmie zrealizowanym w czasie Festiwalu Nauki, który dostępny jest w serwisie YouTube.

GŁÓWNE KIERUNKI BADAŃ

  • Badanie spektrum substratowego EBDH, S25DH i PEDH oraz chromatograficzna chiralna analiza produktów reakcji.
  • Badania kinetyki i termodynamiki redukcji i utleniania enzymu.
  • Badania inhibicji i deaktywacji enzymu.
  • Badania nad immobilizacją EBDH, S25DH i PEDH.
  • Badania nad opracowaniem systemu nadekspresji dla enzymów molibdenowych
  • Badania nad optymalnym systemem reaktorowym i układem do ekstrakcji produktów reakcji dla badanych enzymów.
  • Modelowanie ścieżek reakcji metodami chemii kwantowej (QM i QM:MM).
  • Modelowanie reaktywności enzymy metodami analizy korelacyjnej (QSAR).

STOSOWANE METODY

  • Spektroskopowe techniki badania aktywności enzymu z różnymi substratami bazujące na fotometrycznym teście aktywności (UV/Vis). Badania połówkowego cyklu reakcji metodami szybkiej kinetyki stopped-flow przy współpracy Zespołu Chemii Bionieorganicznej prof. Grażyny Stochel z Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego.
  • Zastosowanie FPLC i technik elektroforetycznych do oczyszczania i monitorowania czystości enzym.
  • Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorami DAD i MS (LC-DAD-ESI/APCI-MS) i gazowej GC-MS do separacji produktów reakcji katalizowanych przez EBDH z wykorzystaniem kolumn RP i chiralnych
  • Zastosowanie chromatografii gazowej z detekcją masową (GC-MS) do separacji produktów reakcji katalizowanych przez EBDH
  • Zastosowanie ekstrakcji ciecz-ciecz i ciecz-ciało stałe (SPE) do otrzymywania produktów reakcji.
  • Izotermiczna kalorymetria titracyjna (ITC)jako metoda badania termodynamiki reakcji enzymatycznej.
  • Kwantowo-mechaniczne modelowanie struktury molibdenowego centrum aktywnego oraz weryfikacja hipotez dotyczących mechanizmu reakcji EBDH z różnymi substratami.
  • Zastosowanie metodologii QSAR i sztucznych sieci neuronowych do modelowania kinetyki enzymatycznej w oparciu o parametry kwantowo-mechaniczne

GŁÓWNE OSIĄGNIĘCIA

  • Opracowanie aerobowej techniki oczyszczania dehydrogenazy etylobenzenowej i dehydrogenazy C-25 steroidowej.
  • Przebadanie spektrum substratowego dehydrogenazy etylobenzenowej i dehydrogenazy fenyloetanolowej, identyfikacja produktów reakcji metodami LC-MS i GC-MS.
  • Optymalizacja standardowego testu aktywności S25DH metodą UV-vis dla cholest-4-en-3-onu.
  • Opracowanie metody immobilizacji EBDH oraz optymalizacja warunków reaktorowych umożliwiających aplikację przemysłową (zgłoszenie patentowe P.406286)
  • Opracowanie modelowych systemów opartych o sztuczne sieci neuronowe do przewidywania aktywności biologicznej substratów i inhibitorów dehydrogenazy etylobenzenowej.
  • Stworzenie i teoretyczna weryfikacja hipotezy mechanizmu reakcji utleniania etylobenzenu do (S)-1-fenyloetanolu w oparciu o badania eksperymentalne i obliczenia kwantowo-mechaniczne.

    Mechanizm reakcji - obliczenia kwantowo-chemiczne

 

WSPÓŁPRACA NAUKOWA