Międzyinstytutowe Laboratorium Biotechnologii i Katalizy Enzymatycznej

Badania Międzyinstytutowego Laboratorium Biotechnologii i Katalizy Enzymatycznej, pracującego w oparciu o bazę sprzętową Instytutu Katalizy oraz Instytutu Fizjologii Roślin Polskiej Akademii Nauk skupiają się na badaniu enzymów katalizujących reakcje syntezy chiralnie czystych alkoholi alkiloaromatycznych. Obecnie laboratorium zajmuje się głównie dwoma systemami enzymatycznymi, dehydrogenazą etylobenzenową (EBDH) oraz dehydrogenazą fenyloetanolową (PEDH). Badania prowadzone w MLBKE są częścią dużego projektu POIG "Biotransformacje dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego".

Laboratorium stanowi dodatkowo platformę integracji środowisk naukowych, dając możliwość połączenia bazy sprzętowo-badawczej Instytutu Katalizy i Fizykochemii Powierzchni z Instytutem Fizjologii Roślin.

EBDH

Dehydrogenaza etylobenzenowa (EBDH) jest bakteryjnym enzymem z Aromatoleum aromaticum, należącym do mononuklearnych enzymów molibdenowych z rodziny reduktaz DMSO. EBDH jest pierwszym, kluczowym enzymem w beztlenowym szlaku mineralizacji etylobenzenu, który umożliwia wzrost bakterii Aromatoleum aromaticum na pożywce bogatej w etylobenzen i azotany w środowisku beztlenowym.

Enzymy molibdenowe charakteryzują się specyficznym centrum aktywnym, zawierającym pojedynczy atom molibdenu, jeden lub dwa kofaktory pterydynowe oraz dodatkowe ligandy - najczęściej resztę aminokwasową (Ser, Cys, SeCys, Asp) oraz zazwyczaj ligand tlenowy Mo=O.

Podstawowym obiektem badań jest dehydrogenaza etylobenzenowa (EBDH), złożony enzym bakteryjny ( αβγ 164 kDa) zawierający centrum monomolibdenowe (MoCo), klastery żelazo-siarkowe oraz grupę hemową typu b₅₅₉, katalizujący stereospecyficzną reakcję hydroksylacji etylobenzenu do 1-(S)-fenyloetanolu.

PEDH

Dehydrogenaza fenyloetanolowa stanowi drugi enzym szlaku biomineralizacji etylobenzenu w bakterii Aromatoleum aromaticum. PEDH należy do rodziny krótkołańcuchowych dehyrogenaz alkoholowych/reduktaz aldehydowych. PEDH jest homotetramerycznym enzymem o masie cząsteczkowej 108 kDa. Katalizuje zależne od NAD⁺  utlenienie (S)-1-fenyloetanolu do acetofenonu lub zależną od NADH stereospecyficzną redukcję acetofenonu do (S)-1-fenyloetanolu.

Badania nad PEDH koncentrują się na aspekcie aplikacyjnym ze względu na potencjalną możliwość zastosowania go w biosyntezie chiralnie czystych alkoholi alkiloaromatycznych. Zastosowanie enzymu do takich syntez jest chronione prawnie przez wspólny patent odkrywcy enzymu, prof. Johanna Heidera z Uniwersytetu w Marburgu oraz firmę BASF AG. Prowadzone w Laboratorium badania mają za zadanie opracować optymalne warunki zastosowania enzymu w przemysłowej syntezie.

GŁÓWNE KIERUNKI BADAŃ

• Badanie spektrum substratowego EBDH i PEDH oraz  chromatograficzna chiralna analiza produktów reakcji.
• Badania kinetyki i termodynamiki redukcji i utleniania enzymu.
• Badania inhibicji i deaktywacji enzymu.
• Badania nad immobilizacją EBDH i PEDH
• Badania nad optymalnym systemem reaktorowym i układem do ekstrakcji produktów reakcji dla obu enzymów.
• Modelowanie ścieżek reakcji metodami chemii kwantowej (QM i QM:MM).
• Modelowanie reaktywności enzymy metodami analizy korelacyjnej (QSAR).

STOSOWANE METODY

• Spektroskopowe techniki badania aktywności enzymu z różnymi substratami bazujące na fotometrycznym teście aktywności (UV/Vis). Badania połówkowego cyklu reakcji metodami szybkiej kinetyki stopped-flow przy współpracy Zespołu Chemii Bionieorganicznej prof. Grażyny Stochel z Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego.
• Zastosowanie FPLC i technik elektroforetycznych do oczyszczania i monitorowania czystości enzym.
• Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorami DAD i MS (LC-DAD-ESI/APCI-MS) i gazowej GC-MS do separacji produktów reakcji katalizowanych przez EBDH z wykorzystaniem kolumn RP i chiralnych
• Zastosowanie chromatografii gazowej z detekcją masową (GC-MS) do separacji produktów reakcji katalizowanych przez EBDH
• Zastosowanie ekstrakcji ciecz-ciecz i ciecz-ciało stałe (SPE) do otrzymywania produktów reakcji.
• Izotermiczna kalorymetria titracyjna (ITC)jako metoda badania termodynamiki reakcji enzymatycznej.
• Kwantowo-mechaniczne modelowanie struktury molibdenowego centrum aktywnego oraz weryfikacja hipotez dotyczących mechanizmu reakcji EBDH z różnymi substratami.
• Zastosowanie metodologii QSAR i sztucznych sieci neuronowych do modelowania kinetyki enzymatycznej w oparciu o parametry kwantowo-mechaniczne

GŁÓWNE OSIĄGNIĘCIA

• Opracowanie aerobowej techniki oczyszczania dehydrogenazy etylobenzenowej.
• Przebadanie spektrum substratowego dehydrogenazy etylobenzenowej, identyfikacja produktów reakcji metodami LC-MS i GC-MS.
• Opracowanie modelowych systemów opartych o sztuczne sieci neuronowe do przewidywania aktywności biologicznej substratów i inhibitorów dehydrogenazy etylobenzenowej.
• Stworzenie i teoretyczna weryfikacja hipotezy mechanizmu reakcji utleniania etylobenzenu do (S)-1-fenyloetanolu w oparciu o badania eksperymentalne i obliczenia kwantowo-mechaniczne.

  

WSPÓŁPRACA NAUKOWA

• Prof. Johann Heider - Laboratory of Microbial Biochemistry, Fachbereich Biologie, Philipps-Universität Marburg, Germany
• Doc. Andrzej M. Skoczowski - Instytut Fizjologii Roślin, PAN, Kraków.
• Prof. Grażyna Stochel - Zespół Fizykochemii Związków Koordynacyjnych i Chemii Bionieorganicznej, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków.
• Projekt POIG "Biotransformacje dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego".